【產(chǎn)品名稱】NK細胞高效擴增試劑盒

【產(chǎn)品組成】試劑盒套裝貨號：661070

套裝內(nèi)容	數(shù)量	單位	保存條件	產(chǎn)品性狀
NK Cell Culture Medium (661071)	2	瓶	2-8℃	液體
NK-A (661072)	1	支	-20℃	液體
NK-B (661073)	1	支	-20℃	液體
NK-C (661074)	1	支	-20℃	液體
NK-D (661075)	1	支	-20℃	液體
NK-E (661076)	1	支	-20℃	凍干粉
NK-F (661077)	1	支	-20℃	凍干粉

【1. 產(chǎn)品介紹】
??本產(chǎn)品是一款NK細胞高效擴增的試劑盒。。外周血/臍帶血中的PBMC/CBMC細胞經(jīng)本試劑盒處理后，在14-16天時間內(nèi)，2L體系細胞總數(shù)可達到6×10⁹-8×10⁹，細胞存活率90%以上，NK細胞比例最高可達90%以上。
? 本試劑盒適用于人外周血/臍帶血和經(jīng)過血細胞單采儀處理獲得的白細胞等來源的樣品。
? 本試劑盒是在符合相關(guān)規(guī)范的無菌環(huán)境中生產(chǎn)，并已通過了嚴格的細菌、真菌、支原體、病毒（HIV、HAV、HBV、HCV）、內(nèi)毒素檢測。本試劑盒不含血漿、動物源成分以及其他不明確成分。
【2. 用戶需要自行準(zhǔn)備的試劑耗材】
0.4%苔盼藍、生理鹽水、人淋巴細胞分離液、肝素鈉（鋰）采血管或100ml采血袋、PBS、75cm²懸浮培養(yǎng)瓶、175cm²培養(yǎng)瓶、細胞培養(yǎng)袋、15ml/50ml/250ml離心管、移液管、5ml和50ml無菌注射器等。

【3. 樣本采集及運輸要求】

3.1、外周血樣本采集應(yīng)為肝素鈉采血管，臍帶血優(yōu)先選擇100ml采血袋，采集過程應(yīng)嚴格規(guī)范無菌。實際采血總量應(yīng)大于50ml，采集后血液與抗凝劑應(yīng)及時混勻。
3.2、樣本運輸條件為18-25℃，24小時處理樣本。

【4. T75培養(yǎng)瓶包被】
4.1、在75CM²懸浮培養(yǎng)瓶中加入8ml生理鹽水和1支NK-A，用電動移液器吹打充分混勻；
4.2、讓混合液在培養(yǎng)瓶表面均勻分布；
4.3、在 37℃ 二氧化碳培養(yǎng)箱中水平放置120-150min；
4.4、小心取出混合液，包被后的培養(yǎng)瓶應(yīng)立即使用，不可劇烈晃動。

【5. PBMC的分離和血漿制備（以50ml樣本THERMO ST16離心機為例）】
5.1 將 50ml 血液樣本均分至2個50ml離心管，3000rpm，10min，取上層血漿轉(zhuǎn)移至新的離心管，56℃，30min 滅活，4℃靜置10min，3000rpm，10min進行離心，用吸管將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，-20℃分裝保存，使用前取出；
5.2 剩下細胞加入生理鹽水至原體積，充分混合均勻，轉(zhuǎn)移至2個裝有15ml淋巴細胞分離液的50ml離心管中，室溫下1800rpm，30min；
5.3 取出PBMC/CBMC至新的50ml離心管；加入生理鹽水至45ml，1600rpm，8min；
5.4 去上清，加入生理鹽水至45ml，充分混勻，取樣計數(shù)；
5.5 1400rpm，10min 收集PBMC/CBMC。

【6. 完全培養(yǎng)基使用說明】
6.1 第一瓶培養(yǎng)基｛NK Cell Culture Medium (661071)｝加入一支NK-E (661076)，充分混勻，配置成完全培養(yǎng)基，使用前恢復(fù)至室溫；
6.2 第二瓶培養(yǎng)基｛NK Cell Culture Medium (661071)｝加入一支NK-F (661077)，充分混勻，配置成完全培養(yǎng)基，使用前恢復(fù)至室溫；
6.3 按順序配置使用
【7. 細胞接種】
7.1 取包被瓶，去包被液待用；
7.2 取45ml完全培養(yǎng)基，加入一支NK-B和5ml自體血漿混勻；
7.3 用混勻后的完全培養(yǎng)基重懸已經(jīng)收集好的單個核細胞；調(diào)整細胞密度1.5-2.0×106cell/ml；（如初始細胞總數(shù)較少，按比例降低接種細胞體積,初始細胞總數(shù)不超過1×10⁸cell/ml）
7.4 D0（指接種當(dāng)天）轉(zhuǎn)移混勻后的細胞懸液至包被瓶，轉(zhuǎn)移過程中不可快速沖刷T-75培養(yǎng)瓶處理面，應(yīng)從側(cè)面緩慢加入后，再緩慢平放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
【8. 補液】
8.1 D3，鏡下觀察有較多克隆團出現(xiàn)，即可補液，如有大量較大的克隆團，可適當(dāng)打散（下同），??轉(zhuǎn)移細胞至T175培養(yǎng)瓶中，補加45ml完全培養(yǎng)基，一支NK-C和5ml自體血漿混勻；
8.2 D5，補加110ml完全培養(yǎng)基，加入一支NK-D和10ml自體血漿，混勻；
8.3 D7，補加200ml完全培養(yǎng)基和10ml自體血漿，混勻，轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)袋；
8.4 D9，分袋，先將培養(yǎng)袋中細胞取一半均分到新的細胞培養(yǎng)袋中， 然后將400ml完全培養(yǎng)基和10ml自體血漿，混勻，均分到2個培養(yǎng)袋中；自體血漿如用完可不添加或用細胞營養(yǎng)添加物替代（下同）；
8.5 D11，往細胞培養(yǎng)袋中分別補加300ml完全培養(yǎng)基和5ml自體血漿，混勻；
8.6 D13，往細胞培養(yǎng)袋中分別補加300ml完全培養(yǎng)基5ml自體血漿，混勻；
8.7 如需擴大培養(yǎng)體系（如3L、4L、6L、8L），使用 NK-F 因子配置的完全培養(yǎng)基繼續(xù)補液培養(yǎng)即可；
8.8 整體根據(jù)細胞密度適當(dāng)補液，補液后細胞密度不低于1.5×10⁶cell/ml。
【9. 收獲】
收獲NK細胞，可根據(jù)實驗情況，適當(dāng)提前或延遲。

【注意事項】
1、 整個補液過程中，每次接種或補液體積因樣本、增值速度、初始細胞總數(shù)等會發(fā)生變化，應(yīng)維持補液后密度不低于1.5×106cell/ml；出現(xiàn)較多較大細胞團可適當(dāng)打散，說明書7中的補液流程可根據(jù)實際細胞狀況做調(diào)整。
2、 分袋時間：根據(jù)試驗的便利性，培養(yǎng)袋里面液體總體積達到1000-1500ml時分袋也可以，不局限于8.4中提到的D9天的分袋時間。
3、 細胞培養(yǎng)袋中總體積在1500-1600ml能最大發(fā)揮培養(yǎng)基效果，不宜過滿，當(dāng)總體積過大還需要繼續(xù)補液培養(yǎng)時應(yīng)及時分袋培養(yǎng)。